Chapter3. Purification of DNA from living cells (살아있는 세포에서 DNA의 정제)
살아있는 cell에서 DNA를 얻고자 하는 것은 아래의 3가지이다.
* total cell DNA : gene이 clone되기 위한 source material
* pure plasmid DNA
* phage DNA : phage DNA vehicle로 사용하기 위해
3.1. Preparation of total cell DNA ( 전체 세포 DNA의 준비)
전반적인 순서는 아래와 같다
① bacteria culture의 grow와 harvest
② cell을 깨뜨리고 열어 content를 release
③ cell extract에서 DNA만 제외하고 모든 component 제거
④ DNA solution을 concentrated 한다.
(1) Growing and harvesting a bacterial culture (박테리아 컬처의 성장과 수확)
거의 모든 bacteria는 liquid medium(broth culture)에서 별 어려움 없이 잘 자란다.
① culture medium (컬처배지)
culture medium은 bacteria가 자라고 효율적으로 divide되도록 essential nutrient의 농도가 balanced된 mixture로 공급되어야 한다.
㈀ M9 : defined medium
* 모든 component가 알려져 있다.
* nitrogen, magnesium, calcium 같은 필수 element 제공의 inorganic nutrient의 mixture 포함
* glucose : carbon과 energy source
* bacterial growth를 위해 trace element나 vitamin 같은 growth factor가 필요.
㈁ Luria-Bertani (LB) : undefined medium
그 components의 identity와 quantity를 모른다.
* tryptone : amino acid, small peptide
* yeast extract(부분적으로 digest된 yeast cell의 dried preparation) : nitrogen requirement, sugar, inorganic, organic nutrients
→ bacteria growth를 위해 더 이상의 supplementation이 필요없다.
② simple DNA source를 얻기 위한 culture
→ complex medium(LB)가 적당
* LB medium에서 37˚C rotary platform에서 150 ~ 250 rpm의 shaking
→ E.coli cell은 20분마다 한번씩 분열, 약 2 ~ 3 x 10^9 cells/ml의 maxium density에 도달할때까지 자란다.
* culture의 growth 측정은 600 nm의 optical density를 측정해서 안다.
→ 600 nm wave length에서 1OD unit은 0.8 x 10^9 cells/ml
* cell extract의 준비
bacteria는 가능한 small volume으로 취하고 harvesting은 culture를 centrifuge해서 준비한다.
→ centrifugation의 속도를 적당히 낮추면 bacteria pellet의 tube 아래에 위치하고 supertanent에 위치한 cuture media는 따라서 버린다.
(2) Preparation of a cell extract (세포 추출물의 준비)
bacterial cell은 cytoplasmic membrane에 들어있고 rigid cell wall에 의해 둘러쌓여 있다.
ex) E,coli는 cell wall 다음에 2차로 outer membrane이 있다.
* bacterial cell을 깨는 방법
㉠ physical method(물리적 방법) : mechanical force(기계적 힘)로 cell을 깬다
㉡ chemical method(화학적 방법) : cell barrier에 영향을 주는 chemical agent(화학적 인자)에 노출하여 cell을 lysis한다.
→ DNA preparation에 많이 쓰임
* Chemical method(화학적 방법)
chemical lysis(화학적 분해)
㉠ cell wall을 공격하는 agent
㉡ cell membrane을 깨는 agent
ex) E.coli
** cell wall
lysozyme(라이소자임) : cell wall rigidity(딱딱한 세포벽)를 유지시키는 polymeric compound(폴리머 구성요소)를 digest(분해)한다.
ethylenediamine tetraacetate(EDTA) : cell envelope(세포를 둘러싸는) 전체 structure를 유지하는 필수 magnesium을 제거한다. DNA를 degrade(분해)하는 cellular enzyme(세포 효소)을 inhibit(방해)한다.
** detergent(세제) : sodium dodecyl sulphate (SDS)
lipid molecule(지방 세포의 일종)의 제거로 lysis(분해) 과정을 돕고 cell membrane(세포막)의 파괴를 이끈다.
* insoluble cell debris(녹지않는 세포의 찌꺼기)의 제거
부분적으로 digest(분해)된 cell wall fraction(세포벽 조각) 같은 compound는 centrifugation(원심분리)에 의해 pelleted(뭉쳐서 아래에 쌓임)된다.
그러면 비교적 clear supernatant(맑은 상액층) 같은 cell extract(세포 추출물)가 남는다.
(3) Purification of DNA from a cell extract (세포 추출물에서 DNA의 정제)
bacterial cell extract에는 protein, RNA, DNA가 들어있다.
① cell extract의 deproteinize(단백질 분해)
phenol과 chloroform의 1:1 mixture를 첨가한다.
→ nucleic acid(DNA,RNA)를 aqueous solution에 남기고 protein만 가라 앉힌다.
* 방법
cell extract를 solvent와 gently mix하고 centrifugation에 의해 layer로 나뉘어진다.
precipitated(침전된) protein molecule이 aqueous와 organic layer 사이에 하얀 coagulated(실타래처럼 엉킨) mass로 남는다.
→ nucleic acid의 aqueous solution은 pipette로 옮긴다.
만약 protein content가 너무 크면 single phenol extraction은 nucleic acid로 완벽히 purify하기엔 충분치 않다.
→ phenol extraction시 mixing과 centrifugation step은 DNA molecule의 손상을 가져올 수 있어 반복사용이 어렵다.
∴ phenol extraction 전에 proteinase K 나 pronase같은 protease를 cell extract에 처리
→ polypeptide를 작은 unit으로 잘라 phenol에 의해 쉽게 제거되게 한다.
** RNA에서 mRNA는 phenol treatment로 제거가 되나 그 외의 RNA는 aqueous layer에 남게된다.
→ ribonuclease enzyme을 써서 ribonucleotide subunit으로 degrade(분해) 시킨다.
(4) Concentration of DNA sample (DNA 샘플의 농축)
dilute solution(농도가 낮은 용액)이 종종 얻어지므로 DNA 농도를 증가시키는 것은 중요하다.
* Ethanol precipitation(에탄올 침전) 방법
salt(sodium ion Na+ 같은 monovalent cation 상태)의 존재하에 temperature -20˚C 이하는 absoulte ethanol은 효과적으로 polymeric acid를 침전시킨다.
glass pod이나 centrifugation으로 DNA molecule을 구함
Ethanol precipitation은 short-chain과 monomeric nucleic acid component를 solution에 남기므로 이때 robonuclease treatment에 의해 ribonucleotide(RNA)가 없어진다.
(5) Measurement of DNA concentration (DNA 농도의 측정)
Ultraviolet(UV) absorbance spectrophotometry(방사선 흡수 측정기)에 의해 DNA 농도가 측정가능하다.
→ DNA solution에 의해 흡수된 UV radiation(방사선)의 양은 sample의 DNA 양에 비례한다.
wavelength(파장) 260nm에서의 absorbance(흡수도) A260의 1은 ml당 double stranded DNA의 50㎕에 해당한다.
∴ A260 1 = 50㎕/ml
* DNA preparation의 purify 측정
A260/A280 < 1.8
→ DNA가 protein이나 phenol에 의해 오염되었음을 암시한다.
(6) Preparation of total cell DNA from organisms other than bacteria (박테리아가 아닌 다른 생물에서의 전체 세포 DNA의 정제)
사용되는 cell의 특별한 성질에 따라 좀 modification이 된 방법이 필요하다.
① Cell breakage stage(세포를 깨는 단계)에 의한 수정 필요
chemical이 cell의 종류에 따라 기능의 차이가 있다.
② DNA에서 cell의 extracted biochemical(생화학적) content(내용물)에 의한 수정 필요
ex) most bacteria
cell extract → DNA(leave pure DNA sample), RNA(ribonuclease 처리하여 없앰), protein(phenol extraction, protease treatment에 의한 제거)
그러나, plant tissue에서는 상황이 다르다.
많은 양의 biochemical(carbohydrate) 때문에 phenol extraction에 의한 제거 효율이 저하된다.
그러므로 아래와 같은 방법을 추가한 수정이 필요하다.
㉠ Cetyltrimethylammonium(CTAB) detergent 사용 → nucleic acid와 insoluble complex 형성.
∴ plant cell extract에 CTAB를 첨가하면, CTAB-nucleic acid complex가 침전되고 carbohydrate, protein, 다른 contaminant(오염물질)는 supernatant(상액층)에 남는다.
precipitate(침전물)는 centrifugation(원심분리)으로 모으고 1M NaCl로 resuspend하고 complex를 깬다.
Ribonuclease treatment로 RNA를 제거하여 pure plant DNA를 얻는다.
㉡ Guanidinium thiocyanate compound를 포함한 방법
guanidinium thiocyanate는 nucleic acid를 제외한 모든 biochemical을 denature하고 dissolve한다. 그러므로 어떤 tissue type이라도 DNA release가 가능하다.
guanidinium thiocyanate 존재하에 DNA는 silica particle에 tight하게 bind한다.
→ biochemical의 denatured mix에서 chromatography column을 통해 DNA를 쉽게 얻을 수 있다. column의 silica particle + DNA complex는 늦게 내려오고 그 외는 빨리 내려오는 것을 이용하여 얻은 다음, 물을 첨가하여 DNA와 silica와 interaction을 깨서 DNA를 얻는다.
|
visited today,
visited yesterday,
visited in sum.