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인트론

2003-02-15 11:51:58 | Hit : 10952 | Vote : 2315

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플라스미드 DNA의 준비

Preparation of plasmid DNA (플라스미드 DNA의 준비)
플라스미드는 프랜스포메이션을 위한 벡터로서 쓰입니다.
지금은 거의 모든 벡터를 사서 쓰고 있지만, 이 플라스미드 벡터를 어떻게 구하는지 알아봅시다.

(1) 크기에 기초한 플라스미드 DNA의 분리(Separation on the basis of size)
① EDTA와 라이소자임(lysozyme)을 수크로스(sucrose) 존재하에 처리하면 세포(cell)의 급진적 산화(immediately bursting)를 막으면서,
부분적으로 파괴(degrade)된 세포벽(cell wall)과 소량의 세포막(intact cytoplasmic membrane)이 남아있는 상태인 sphaeroplast가 형성이 됩니다.
이 때는 아주 미량의 염색질 DNA(chromosomal DNA) 파괴만 일어납니다.
② Triton X-100같은 무이온성 세제(non-ionic detergent)를 추가하면 세포용해(cell lysis)가 됩니다.
그러나 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 사용하면, 염색질 분해(chromosomal breakage)를 야기하게 되므로 잘 사용안합니다.
③ 그런 후에 원심분리(centrifugation)를 하면 플라스미드 DNA(plasmid DNA)로 이뤄진 맑게 용해된 상층액 물질(cleared lysate)이 나옵니다.
즉, DNA 조각(DNA fragment)과 세포찌꺼기(cell debris)는 아래에 쌓이게 되지요.
* 단점 : 그러나 맑게 용해된 상층액 물질(cleared lysate)에 약간의 염색질 DNA(chromosomal DNA)가 남을 수도 있습니다.
또한 플라스미드 DNA(plasmid DNA)가 크기가 클 경우 세포찌꺼기(cell debris)와 침전 가능성이 있는 단점이 있습니다.

(2) 구조에 기초한 플라스미드 DNA의 분리(Separation on the basis of conformation)
# 플라스미드(plasmid)의 구조(conformation)에 대해서 먼저 알아봅시다.
원형이중가닥 DNA(double stranded DNA circle)이 꽤 다른 두가지 구조(conformation)를 가지므로 플라스미드(plasmid)가 원형구조(circular form)이라 말하기 어렵습니다.
* 초나선형 모양(supercoiled form)
많은 plasmid가 이 상태로 존재하다가 플라스미드 복제(plasmid replication) 동안에는 토포아이소머레이즈(topoisomerase) 불리는 효소(enzyme)에 의해 부분적으로 감기지 않은 플라스미드 DNA(unwound plasmid DNA)가 이때 생깁니다.
초나선형 구조(supercoiled conformation)는 폴리뉴클레오타이드 (polynucleotide)가 완전할때, 즉 공유결합적으로 닫힌 원형 DNA(covalently closed-circular(ccc) DNA)일때만 유지가 됩니다.
만약, 폴리뉴클레오타이드 가닥(polynucleotide strand)의 하나가 깨지면 이중나선구조(double helix)가 보통 이완된 상태(normal relaxed state)인, 열린 원형 DNA 구조(open circular(OC) form)로 바뀝니다.

∴ 초나선형(supercoiling)의 구조(conformation)를 이용하여 non-supercoiled molecule에서 supercoiled molecule을 쉽게 분리가 가능하게 됩니다.

① Alkaline denaturation (알카라인 변성)
* 좁은 pH 범위에서 non-supercoiled DNA는 denature된다.
* 반면, supercoiled DNA는 denature가 되지 않는다.
ⓐ sodium hydrooxide(NaOH)를 cell extract나 cleared lysate에 첨가한다.
ⓑ pH가 12.0 ~ 12.5 사이로 변해 non-supercoiled DNA molecule의 hydrogen bonding(수소결합)이 깨진다.
ⓒ acid가 첨가되면, bacterial denatured DNA reaggregate(재모임) 되어 tangled mass(엉킨 덩어리)를 형성한다.
ⓓ centrifuge해서 supernatant(상액층)의 pure plasmid DNA를 얻는다.
장점 : SDS에 의한 cell lysis와 sodium acetate에 의한 neutralization(중화) 상황에서 protein과 RNA는 insoluble하여 centrifugation(원심분리) step에서 제거된다.
→ phenol extraction과 ribonuclease treatment(RNA 제거제 공정)가 필요없다.

② Ethidium bromide-caesium chloride density gradient centrifugation (Ethidium bromide-CsCl)
equilibrium(평형)이나 density gradient centrifugation 기법을 응용한 방법이다.
caesium chloride(CsCl)을 매우 높은 속도로 centrifugation하면 density gradient(밀도 그레디언트)가 생긴다.
→ 높은 centrifugal force(원심분리력)가 caesuim(세슘)과 chloride ion을 tube의 바닥에 당겨서 gradient가 생긴다.
(downward migration(아래쪽으로 이동)이 diffusion(확산)에 의해 counterbalanced되고, CsCl density가 tube 바닥 쪽으로 더 커져 concentration gradient가 생긴다.)
particular molecule의 band는 그것의 buoyant density(부력 밀도)에 따라 특정위치의 gradient에 band가 형성된다.
* DNA buoyant density(부력밀도) 1.7g/cm^3 → CsCl density gradient(부력밀도)의 1.7g/cm^3의 위치에 band가 위치하게 됨
* protein molecule : lower buoyant density(부력밀도) → tube 위에 뜸
* RNA : 바닥에 pellet 형성
∴ DNA purification에서의 phenol extraction과 ribonuclease treatment의 대체법이다.

# EtBr (ethidium bromide)
double helix DNA에서 이웃한 base pair 사이에 intercalating(상호결합하여 끼어듬)하여 DNA molecule에 binding한다.
→ double helix의 부분적인 unwinding(풀림)을 유도한다. buoyant density(부력밀도)를 줄이게 되어 linear DNA보다 0.123g/cm^3으로 낮춰진다.
그러나, 상대적으로 supercoiled DNA는 free end가 없기 때문에 거의 풀어지지 않아 아주 제한된 양의 EtBr만이 binding(결합)하게 되므로 supercoiled molecule의 buoyant density(부력밀도)는 아주 작은 양 0.085g/cm^3 만큼만 줄어들게 된다.
∴ EtBr-CsCl gradient에서 supercolide molecule은 linear와 open-circular DNA와 다른 position(위치)에 band를 형성하게 된다.

Ethidium bromide-caesium chloride density gradient centrifugation은 pure plasmid DNA를 얻는데 매우 효과적인 방법이다.
→ DNA band의 position은 tube에 ultraviolet radiation(방사선)을 비추면 bound된 EtBr이 형광을 띠어 식별할 수 있다.(UV → red)
plasmid에 bound(결합)된 EtBr은 n-butanol로 빠져나오게 할 수 있으며, CsCl은 dialysis(투석)로 제거한다.
→ 100 % pure plasmid preparation 준비가 가능하게 된다 → cloning vector로 사용한다.

(3) Plasmid amplification (플라스미드 증폭)
plasmid의 yield(수율)를 높이는 것
* multy copy plasmid : bacteria 안에 20개 이상의 plasmid copy number를 가지고 있다.

bacterial chromosome(염색체)은 아래의 condition(상황)에서는 replicate(복제)하지 못하고, protein synthesis(합성) 없이 plasmid DNA만 replicate(합성)할 수 있는 성질이 있다.
- plasmid DNA purification(플라스미드 DNA 정제)을 위해 bacterial culture growth에서 cell density(세포밀도)가 충분하게 도달했을때, protein synthesis inhibitor(단백질 합성 억제제)인 chloramphenicol을 첨가하여 12시간 동안 culture를 더 incubate(배양)한다. 이때 plasmid molecule은 계속 replicate(복제)되고, chromosome replication(염색체 복제)과 cell division(세포 분열)은 block(막음)된다.
∴ plasmid copy number가 엄청 증가하여 multy copy plasmid의 yield(수율)도 증가하게 된다.

* 오영민님에 의해서 게시물 이동되었습니다 (2004-05-08 18:09)

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